Keuskupan Atambua mulanya didirikan sebagai Vikariat Apostolik Timor Olandese (Timor Belanda) pada 25 Mei 1936, dipisahkan dari Vikariat Apostolik Isole della Piccola Sonda (Kepulauan Sunda Kecil). Pada tahun 1948 namanya diganti menjadi Vikariat Apostolik Atambua. Ketika hierarki Gereja Katolik di Indonesia didirikan oleh Paus Yohanes XXIII dengan konstitusi apostolik Quod Christus pada 3 Januari 1961, statusnya ditingkatkan menjadi diosis (keuskupan). Maka menjadi Keuskupan Atambua. Pada tahun 1967 dimekarkan menjadi dua keuskupan, yaitu Keuskupan Atambua dan Keuskupan Kupang.

Peristiwa besar, yakni pertama, mendaratnya para misionaris pertama dari Portugis di Pantai Lifao, Timor (sekarang bagian dari Negara Timor Leste) pada Desember 1555 dan pembaptisan sekitar 5.000 orang Timor oleh Padre Antonio Taveira, OP pada tahun 1556, menjadi penanda awal misi Katolik di Pulau Timor.

Pada tahun 1883, para misionaris Yesuit mendirikan stasi yang pertama di Atapupu dan pada tahun 1886 di Lahurus. Selanjutnya pada tahun 1913 pelayanan di Timor diserahkan kepada para misionaris Societas Verbi DIvini (SVD) dengan Lahurus sebagai pusat misi pada waktu itu. Pada 16 Juli 1889, di Lahurus berdirilah Sekolah Dasar pertama di Timor.

Tahun 1913 Pulau Timor menjadi bagian dari wilayah Prefektur Apostolik Kepulauan Sunda Kecil dengan Mgr. Petrus Noyen, SVD sebagai Prefektur Apostolik. Guru-guru Agama mulai memegang peranan penting dalam meletakkan dasar Kristiani di kalangan Umat Katolik Timor.

Tahun 1936, Timor menjadi Vikariat sendiri dengan nama “Vicariat Apostolik Atambua” dan Mgr. Jacobus Pessers, SVD ditunjuk sebagai Vikaris Apostolik pertama pada 16 Juni 1937. Pada waktu itu sudah ada sekitar 42.000 umat Katolik yang dilayani oleh 19 Imam, 3 Bruder dan 12 Suster.

Seminari Menengah Lalian, satu-satunya Seminari dalam Keuskupan Atambua, didirikan pada 8 September 1950. Tahun 1957 didirikan Biara Santo Yosef Nenuk tempat pembinaan bagi Bruder-bruder Timor.

Pada 3 Januari 1961, Vikariat Apostolik Atambua menjadi Keuskupan Atambua dan sebagai Gereja setempat Keuskupan Atambua dipimpin oleh Mgr. Theodorus Sulama, SVD. Tanggal 21 September 2007 merupakan hari bersejarah dimana terjadi pentahbisan Uskup Atambua yang baru dan sekaligus peralihan kepemimpinan dari Mgr. Anton Pain Ratu, SVD (1984-2007) kepada penggantinya Mgr. Dr. Dominikus Saku, seorang imam Projo Keuskupan Atambua.